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降落数值测定仪如何测定小麦淀粉酶活力?



测量的步骤如下:

1.酶液提取:称取25℃下萌发3~4天的小麦种子1.0g(芽长1.0~1.5cm),置研钵中,加少量石英砂和2ml蒸馏水,研磨成匀浆后转入离心管中,用7ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取15~20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。
然后在3000rpm转速下离心10min,将上清液倒入50ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml,放入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀分酶稀释液。

2.麦芽糖标准曲线制作:取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表33-1加入试剂。
表33-1  制作麦芽糖标准曲线配方表
试剂管号 1 2 3 4 5 6 7
麦芽糖标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2. 1.6 2.0
蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量(mg) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
3,5-二硝基水杨酸(ml) 2 2 2 2 2 2 2

摇匀,置沸水中浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。

3.酶活力的测定:取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表33-2进行操作。 
表33-2  配活力的测定配方表
操作项目管号 Ⅰ-1 Ⅰ-2 Ⅰ-3 Ⅱ-1 Ⅱ-2 Ⅱ-3 
淀粉酶原液(ml) 1.0 1.0 1.0 0 0 0
钝化β-淀粉酶 置70℃水浴中15min,取出后在流水中冷却
淀粉酶稀释液(ml) 0 0 0 1 1 1
DNS试剂(ml) 2.0 0 0 2.0 0 0
预保温 40℃恒温水浴中保温10min
1%淀粉溶液(ml)(40℃) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
保温 40℃恒温水浴中准确保温5min
DNS试剂(ml) 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0

摇匀,置沸水浴中5min,取出后冷却,加蒸馏水至20ml。摇匀,在540nm波长下比色,记录测定结果。

4.结果计算:用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα),淀粉酶活性以麦芽糖mg·g-1·min-1表示:
Aα=
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),按下式计算(α+β)-淀粉酶总活力AT:
AT=
式中  A—淀粉酶活性,Aα为α-淀粉酶的活性,AT为淀粉酶总活性,主要是α、β淀粉酶的活性;
Cα—α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值,以下同);
CT—(α+β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量;
V1—显色所用酶液体积(ml);
t—酶作用时间(min);
Vt—样液稀液总体积(α-淀粉酶为50ml,α+β淀粉酶为500ml);
FW—样品鲜重(g)。

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